Trước khi thí nghiệm, tất cả thuốc thử và mẫu phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng; sau khi nấu chảy lại, ly tâm lại mẫu và lấy phần nổi phía trên để xét nghiệm; đối với thuốc thử hoặc chuẩn bị mẫu, trộn đều và tránh tạo bọt; hiệu chuẩn và các mẫu được khuyến nghị để thử nghiệm trùng lặp.

1. Thêm lần lượt: lần lượt thêm dung dịch làm việc tiêu chuẩn vào hai giếng đầu tiên và thêm hai lỗ cho mỗi nồng độ của dung dịch làm việc, 100 μ L của mỗi giếng. Các mẫu cần kiểm tra được thêm vào các giếng khác, 100 μ L mỗi giếng (đối với nồng độ mẫu trên phạm vi thử nghiệm, mẫu được pha loãng với chất chuẩn & độ pha loãng mẫu). Đĩa vi bản được phủ phim và ủ ở 37 ℃ trong 90 phút. Mẹo: Khi thêm mẫu vào đáy của tấm vi mạch, cố gắng không chạm vào thành lỗ, lắc nhẹ và trộn để tránh tạo bọt khí. Thời gian bổ sung nên được kiểm soát trong vòng 10 phút.

2. Kháng thể/kháng nguyên đánh dấu biotin: loại bỏ chất lỏng và lắc khô, không rửa. 100 μL dung dịch làm việc kháng thể/kháng nguyên đánh dấu biotin ngay lập tức được bổ sung vào từng giếng, trộn đều, vi đĩa cộng với màng bọc và ủ ở 37℃ trong 1 giờ.

3. Rửa: lắc chất lỏng trong lỗ, thêm 350 μ L chất lỏng rửa vào mỗi giếng, ngâm trong 1-2 phút, hút hoặc lắc chất lỏng trong tấm vi mạch và lau khô trên giấy thấm dày. Lặp lại bước rửa tấm này 3 lần. Mẹo: Máy giặt có thể được sử dụng ở đây và trong các bước giặt khác. Mỗi bước giặt là cần thiết cho thí nghiệm.

4. Liên hợp enzyme HRP: 100 μ L dung dịch làm việc liên hợp enzyme mỗi giếng, trộn đều, phủ màng và ủ ở 37 ℃ 30 phút.

5. Rửa: loại bỏ chất lỏng trong giếng và rửa tấm 5 lần theo cách tương tự như bước 3.

6. Chất nền: thêm 90 μL dung dịch chất nền (TMB) vào mỗi giếng, trộn đều, thêm màng bao và ủ ở 37℃ trong khoảng 15 phút. Lưu ý: Thời gian ủ nên được rút ngắn hoặc kéo dài tùy theo tình hình phát triển màu thực tế, nhưng không quá 30 phút. Nó có thể được chấm dứt khi một gradient rõ ràng xuất hiện trong lỗ tiêu chuẩn.

7. Chấm dứt: Thêm 50 μ L dung dịch kết thúc cho mỗi giếng để kết thúc phản ứng. Lưu ý: thứ tự bổ sung của dung dịch kết thúc phải giống với thứ tự của dung dịch cơ chất.

8. Đọc: Đo ngay mật độ quang học (OD) của từng giếng ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi bản. Đầu đọc vi bản nên được mở trước để thiết lập quy trình xét nghiệm.

9. Sau thí nghiệm, đặt lại thuốc thử chưa sử dụng vào tủ lạnh theo nhiệt độ bảo quản quy định cho đến khi hết hạn sử dụng.